| abstract | - Pro E. coli
* Billiges Nährmedium
* Generationszeit
* Vektoren (Plasmide)
* Gute Transformation mit Plasmiden
* Leicht mit Phagen zu infizieren
* Plasmiden leicht von chrDNA trannbar
* K12-Laborstämme
* Voll sequenziert (4600) Restriktionsendonukleasen 3 Typen Typ II – Restriktionsenzyme erzeugen verschiedene Enden
* EcoRI sticky, 5’ overhang, GAATTC
* EcoRV blunt
* PstI sticky, 3’ overhang Methylierung in E. coli
* EcoKI Restriktion fremder DNA
* DAM (methyliert an Adenosin) DNA-Reparatur
* DCM nich bekannt Methylierung in Eukaryoten (Methyliere Promotoren inaktiv, Inaktivierung von Repetitiven Sequenzen)
* Hefe keine
* Wirbeltiere an Cytosin (CG)
* Pflanzen an Cytosin (CNG)
* Zirkulär, ds DNA
* Unabh. Repliziert
* Resistenzen
* Konjugation Konjugation:
* Tra-Gene (Pili-Synthese)
* Mob-Gene (Mobilisierungsproteine)
* Nick/bom-Gene (oriT(ransfer) = Mobilisierungsstelle)
* Vorgang: mob-Prot. bindet an nick/bom Relaxationskomplex Strangbruch ssDNA übertragen Replikation und Verteilung
* Unidirektional u. > bidirektional
* oriV = Replikationsursprung
* Kopienzahl:
* Bei pMB1 (ColE1) Replikationskontrolle durch selbst synthetisierte RNA (Hybridbildg)
* Rop-Protein (repressor of Primer) stabilisiert Hybridbildg. repl. Senkung
* Relaxiert kontrollierte Replikation hohe Kopienzah, Stringent kontr. Repl. geringe Kopzahl.
* Verteilung:
* Gleichmäßige Verteilung auf Tochterzellen = Stabilität eines Plasmid
* par-Loci (partition)
* cis Lokus Anheftg. Der Plasmiden an Membran Zusammenhänge für Plasmiden:
* je kleiner Plasmid, desto höher Kopienzahl
* je niedriger Kopienzahl, desto höher Stabilität
* kleine Plasmide geringe Stabilität Inkompatibilität und Wirtsbereich
* Inkompatibilitätsgruppen (Inc) = Verwandte Plasmide nicht stabil repliziert u. weitervererbt
* Da: = Replikationsaparat (oriV), = Elemente f. Kopienzahl, = Elemente f. Verteilung
* Narrow host range (z.B. ColE1)
* Broad host range (RK2) shuttle-Vektoren Antibiotike und Resistenz:
* Metabolite mit nierigem Molekulargewicht (1000 D)
* Hemmen Wachstum inhibieren essentielles Makromolekül
* Mechanismen der Resistenz
* Mutation des Zielproteins
* Erhöhte Produktion des Zielproteins
* Chem. Veränderung der anbak. Substanz
* Verhinderung der Aufnahme Antibioika Wirkungsweise:
* Beta-Lactam-Antibiotika: Ampicillin, Bak., Inhib. Zellwand-Synthese, spaltung beta-Lactam-Ring durch beta-Lactamase
* Tetracycline, Bak., Inhib. Proteinsynthese (ribosomale Proteine), Aufnahme verhindert durch Membranproteine
* Aminoglycoside: Kanamysin, Bak./Euk., Inhib. Proteinsynthese
* Chloramphenicol, Bak., Inhib. Proteinsynthese, Acetylierung durch CAT
* Blemocin-Familie, Bak/Euk, DNA-Degration, Bindg. Des Antibitotikums Eigenschaften Klonierungsvektoren:
* Autonome Replikation
* Klein (bessere Effizienz v. Ligation)
* Selektionsmarker
* Keine Restriktionsstellen abseits der Insertstelle
* Viele singuläre Restriktionsstellen bei Insertstelle
* Singuläre Restriktionsstelle in Marker (Resistenzgen) Inaktivierung bei Insert
* Hohe Kopienzahl (pBluescript 100)
* Verbreitung nicht über Konjugation pBR322-Vektor:
* PstI (Schnittstelle=Klonierungsstelle) in Ampicillin-Resistenz-Element (ApR)
* Tetracyclin-Resistenz (TcR)
* Identifizierung von Rekombinanten mit pBR322 (siehe Buch)
* Nachteile
* Relativ Groß
* Wenige Schnittstellen
* Selektion umständlich (Stempeln)
* Keine zusätliche Schnittstelle neben Klonierstelle (für Removing) Lac-Operon: Repression durch Lac-Repressor:
* lacZ beta Galactosidase (Lacrosespaltung Glucose)
* lacY Lactose-Permease (Lactoseaufnahme)
* lacA Transacetylase (entgriftet toxische Galactoside)
* lacI gehört nicht zum Operon Lax-Repressor (bindet an Lac-Operon, verhindert Transkription)
* natürlicher Indukor (Gegeteil v. Inhibitor) = Allolactose (v. beta Galactosidase gebildet)
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